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        合作文章COOPERATION ARTICLE

        項目文章|微囊藻素降解有妙招?群體感應系統前來報道!

        來源:admin    發布時間:2020-07-15   閱讀數:1083

        美格基因項目文章再下一城!近日,清華大學深圳國際研究生院海洋科學與技術學部蔡中華研究員及其研究團隊的研究成果刊登Water Research。研究針對微囊藻毒素降解菌Novosphingobium sp. ERW19的兩套群體感應系統進行了探索。本文的通訊作者為周進老師,曾艷華博士后參與了本次研究的主要工作。熱烈祝賀蔡中華研究員及其研究團隊!

        Two hierarchical LuxR-LuxI type quorum sensing systems in Novosphingobium activate microcystin degradation through transcriptional regulation of the mlr pathway Novosphingobium 的雙層級LuxR-LuxI型群體感應系統通過調控mlr通路的轉錄來激活微囊藻素降解

        微囊藻素降解有妙招?群體感應系統前來報道出處證明圖

        作者:Yan-Hua Zeng, Zhong-Hua Cai, Jian-Ming Zhu, Xiao-Peng Du, Jin Zhou

        期刊:Water Research

        時間:2020.6.22

        IF:7.913

        DOI: 10.1016/j.watres.2020.116092


        摘要

        有害赤潮產生的微囊藻毒素 (Microcystins,MCs) 是最常見的藍藻毒素,它在全球范圍對人類健康和生態環境都造成了威脅。生物降解能有效且持續的消除MCs。雖然MCs的生物降解代謝途徑已經探明,但降解過程的調控機理仍不明了。群體感應(Quorum sensing,QS)是一種細胞密度調控機制,可幫助細菌協調集體行為。?;呓z氨酸內酯(acyl-homoserine lactone,AHL)介導的QS系統能調節多種有機污染物的生物降解,但這個系統能否降解MCs還是未知數。在該研究中,MCs能使AHL產生菌比例大幅增加,依賴于AHL的QS系統出現在所有MC降解細菌中,證明QS參與MCs的降解。針對mlr降解途徑的marker基因mlrA設計新引物,我們分離到了兩株擁有MC降解和AHL生產功能的Novosphingobium菌株。其中Novosphingobium sp. ERW19編碼雙層級QS調控系統novR1/novI1和novR2/novI2?;蚯贸把a償實驗證明這兩套系統對于MCs的完全降解很重要。轉錄組分析顯示QS系統可激活MC降解基因尤其是mlrA來降解MCs。QS可能是MC降解細菌的特征,調控QS系統是控制MCs降解的有效策略。


        實驗設計

        1、于太湖赤潮期間取水樣,分離水樣的微生物,及在水樣中添加MCs富集微生物。篩選能產生AHL的陽性菌,最后篩選到2株還檢測到mlrA基因的菌株Novosphingobium sp. ERW19和ERN07,對其進行基因組測序和草圖組裝分析;

        2、測試Novosphingobium sp. ERW19及其變種降解MCs的能力;

        3、分別構建Novosphingobium sp. ERW19菌株的QS缺失缺陷體和補償菌株。分析AHL合成情況、MCs降解及AHL合成核心基因的表達情況;

        4、使用RNA測序檢測各菌株的基因表達量(美格基因承擔本研究RNA測序分析工作)。


        實驗結果

        1、富集前后AHL生產菌的變化

        AHL是細胞間最常用于交流的自誘導劑。從赤潮水樣中分離到120個菌株中有11種具有AHL生產能力,富集后得到的41種菌株中有13種具備AHL生產能力。這說明信號交流可顯著增加AHL生產菌的豐度,反映了QS可能參與MC降解細菌的生物降解行為。

        以上的24種AHL生產菌都是變形菌,主要分為Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria 兩個綱。圖1展示了AHL生產菌富集前后的群落變化,富集前高豐度物種有Aeromonas(63.64%)和Rhizobium (18.18%)等,富集后演替成Novosphingobium(46.15%)和Rhizobium (15.38%)等。

        富集前后赤潮水樣中的AHL生產菌的相對豐度圖
        圖1 富集前后赤潮水樣中的AHL生產菌的相對豐度

        2、依據AHL生產能力篩選MC降解菌

        mlrA基因是能降解MCs的marker基因,本實驗針對該基因設計新引物mlrA-271F和mlrA-806R作為快速篩選MCs降解菌的工具。從菌株ERW19和ERN07中成功擴增出了mlrA基因,該基因與Novosphingobium sp. THN1的序列相似性為100%。


        3、MC降解菌基因組的QS鑒定和AHL合酶的功能驗證

        目前已經測序過的7株MC降解菌都屬于Sphingomonadaceae科,都至少含有一個AHL驅動的QS回路,而該科其他無降解功能的細菌卻沒有該結構。這也說明了基于AHL的QS系統與MC降解之間關聯緊密。 對7株MC降解菌的luxR/luxI基因進行線性分析,發現了11個luxI同源基因,所有luxR位于luxI上游。luxI的氨基酸序列可分為3類(圖2A,B),相似性在22%到100%之間。 將降解MCs能力更強的Novosphingobium sp. ERW19的QS系統作為典型代表進行研究。該菌株有2個AHL合酶ERW19_NovI1和ERW19_NovI2,它們的產物不同(圖2C),前者的產物似乎是Sphingomonadaceae的主要信號物。

        七株MCs降解菌的luxI/R 共線性分析圖
        圖2 七株MCs降解菌的luxI/R 共線性分析

        4、Novosphingobium sp. ERW19的QS系統特征

        該菌編碼2個完整的luxR/luxI型QS系統,novR1/novI1和novR2/novI2。WT株系與農桿菌A136共培養24h后能產生藍色斑點,說明WT合成的AHL具有強烈活性。4個QS缺陷體中只有ΔnovR2有明顯的AHL活性(圖3A),提取實驗的結果與這一致(圖3B),這說明在QS系統中novR2可能是AHL的抑制物。兩種類型的AHL可在WT菌株上清液中檢測到(圖3C),novR2的敲除使AHL類型增加了一種。而分別單獨敲除novI1、novR1、novI2后細菌的MCs降解能力顯著降低了。雙敲缺陷體ΔnovI1novI2無法產生AHL,證明ERW19只編碼2種AHL合酶。在QS缺陷體中重新引入之前刪除的基因后,菌株又恢復了AHL生產能力(圖3A)。

        交叉共生實驗鑒定ERW19 WT及其缺陷體的AHL信號物質生產圖
        圖3 交叉共生實驗鑒定ERW19 WT及其缺陷體的AHL信號物質生產

        使用ERW19的WT及其缺陷體來驗證novR1/novI1和novR2/novI2兩種QS系統的關系。分別敲除novR1和novR2基因后,novI1和novI2的表達量顯著增加(圖4),說明兩個AHL合酶受其受體的正調控。刪除novR1后novI2的表達量顯著降低,說明novR1/novI1能夠正調控novR2/novI2。這也解釋了ΔnovR1合成AHL的數量降低的原因是因為novR1抑制了AHL合酶基因的表達。

        novR2的刪除顯著上調了novI1的表達,因此缺陷體ΔnovR2(圖4)能產生更多AHL主要歸功于novI1的高表達??赡苋鄙倭薾ovR2/novI2的競爭,ΔnovR2能產生更多AHL。然而ΔnovI2中的AHL活性非常低(圖4B),可能是其活性受到其他多種因素的共同影響??傊?,ERW19的2個QS系統中,novR1正調控novI2的表達,而novR2會抑制novI1,這樣就形成了一個正/負反饋環。

        ERW19 WT及其缺陷體的AHL合酶基因novI1及novI2的表達量圖
        圖4 ERW19 WT及其缺陷體的AHL合酶基因novI1及novI2的表達量

        5、兩個QS系統的對MCs降解的調控作用

        所有QS缺陷體對MCs的降解能力均降低了(圖5A,C),在基因補償實驗中ΔnovI2和ΔnovR2的MCs降解能力恢復(圖5B,D),但ΔnovI2和ΔnovR2僅部分恢復。

        ERW19 WT、缺陷體及補償菌株中的MCs降解曲線圖
        圖5  ERW19 WT、缺陷體及補償菌株中的MCs降解曲線

        在不同菌株中,涉及MCs降解的兩個QS系統相關基因的表達量和與其MCs降解能力一致(圖3A,B)。雖然novR2的敲除增加了菌株的AHL生產能力,但對MCs的降解效率是有所降低,可能是因為novR2的敲除使novI2的表達也大幅下降(圖5A,C)。由此可知,novR1/novI1和novR2/novI2都能增強QS系統對MCs的降解,任何QS元件的缺失都將導致降解效率降低。

        qPCR也證實了QS系統通過誘導mlr途徑來正調節MCs的降解(圖6)。此外,QS還正調控苯乙酸降解途徑基因,該基因亦參與MCs的下游降解途徑(圖6)。

         基因刪除及恢復對AHL合酶基因表達的影響圖
        圖6  基因刪除及恢復對AHL合酶基因表達的影響

        小結與亮點

        本研究發現,赤潮期間水中的AHL生產菌豐度升高,而所有的MCs降解菌種均含基于AHL的QS系統,因此針對其中的MCs降解菌Novosphingobium sp. ERW19的兩套QS系統進行了探索。研究結果表明novR1可以正調控novI2的表達,而novR2的表達與novI1負相關。兩套QS系統在MCs的降解方面發揮了重要作用。QS系統降解活性的產生由MC降解基因尤其是mlrA的表達誘導??傊?,該研究闡明了QS的MCs生物降解功能,在消除MCs時可以據此來提高生物膜體統的凈化功能。



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