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        微生物組學Microbial Genomics

        COMMON PROBLEMS常見問題

        • 擴增子測序能滿足的測序長度是多少?

          Miseq PE300平臺測序長度為600bp,但其測序質量較差,質控需要過濾掉超過100bp質量較差的序列;Hiseq2500 PE250平臺測序質量較好,但測序總長度為500bp,去掉12bp的barcode和部分質量較差的序列之后只剩460bp左右。所以保守起見,擴增子片段長度不能超過460bp,否則雙端測序結果將無法進行拼接,在引物選擇時應引起注意。

        • DGGE技術與高通量測序技術在環境微生物群落多樣性研究中有什么區別?

          DGGE等分子指紋圖譜技術,在其實驗結果中往往只含有數十條條帶,只能反映出樣品中的優勢種群,需要標準菌株,且受到凝膠電泳特性的局限,無法檢測到稀有菌群的種類,因此其重復性和分辨率都不甚理想。而高通量測序技術能同時對樣品中的優勢種群及微量菌進行檢測,獲得樣品中的微生物群落組成,并將其含量進行數字化。

        • 擴增子測序和宏基因組測序的區別?

          擴增子主要分為16S、18S、ITS等測序,關注環境樣本中的物種組成,該技術物美價廉,實用性高。宏基因組關注環境樣本中的物種組成、功能組成及代謝通路等信息,該技術深入挖掘環境樣本功能層面的信息。

        • 是否需要生物學重復,多少個合適?

          為了數據質量、結果產出及順利投稿,必須注意生物學重復問題??紤]到個體差異,后期組間統計學分析以及偏離樣本,自然環境至少3個生物學重復,推薦5個;若是人類的腸道、糞便等樣品,由于個體特異性高,建議10個以上的重復。

        • 若關注環境中的真核微生物多樣性,18S測序和ITS測序哪個更好?

          ITS測序主要是針對真菌多樣性的研究,注釋準確度高;18S測序針對的是真核微生物,注釋到的范圍廣,但是就真菌來說精確度相對較低;可根據研究目的合理選擇測序方案。

        • 擴增子測序和宏基因組測序的對象主要是環境微生物,請問針對此類樣本推薦的DNA提取方法是什么?

          針對環境樣本推薦老師采用常規的CTAB法或SDS法;其中人和動物組織樣本使用SDS方法,其他樣本采用CTAB法。另外,針對一些較難提取的樣本或您希望提高樣品DNA的提取效果,推薦使用Mobio公司專門的環境樣本DNA提取試劑盒。

        • 分類學注釋中Unclassified、Unidentified及Others分別表示什么意思?f_Legionellaceae和f_Legionellaceae,g_s_有何區別?

          Unidentified:分類學比對時在設定的置信閾值以下或沒有分類信息的reads;Unclassified:在數據庫中沒有找到對應于該序列的分類信息;Others:注釋到多個數據庫的reads;此處應注意,物種相對豐度分布圖中的Others則包含上述三種注釋結果及相對豐度小于1%的物種。g_和s_是數據庫中在屬和種水平有對應的序列信息,但是沒有注釋信息,f_Legionellaceae是數據庫中在屬和種水平沒有對應的序列信息。

        • 樣品OTUs Venn分析圖中每個樣品的OTU數為什么和各樣品所含OTU數及序列數統計表格中的OTU數不對應?

          不同的樣品的序列數不同,為了排除因樣本間測序數目不同而引入的誤差,所以以序列數最低的樣品為標準,對不同樣品進行重抽樣,使各樣品的序列數在同一水平下進行樣品間的比較分析。

        • 物種相對豐度熱圖分析中為什么數據結果的表格中沒有負值,而圖中的圖例有負數?

          直接用相對豐度值進行熱圖的繪制,常常會由于聚類結果中出現相對豐度值分布不均勻,導致大部分豐度較低的物種呈現相同或相近的顏色,不利于樣品及物種間的比較分析,因此我們在繪制之前對數值進行了標準化,即對每一個豐度排在前30的物種單獨進行z-Score并取自然對數后繪制熱圖。

        • Alpha多樣性的結果怎么看,各指數之間是否可以進行比較?

          Alpha多樣性即樣品內部的生物多樣性,跟其他樣品無關,但不同的樣品之間亦可以進行數值上的比較(在序列數目一致的前提下)。Alpha多樣性根據OTU table和系統發育樹進行計算,通常計算的參數包括 observed species指數(OTUs)、chao1指數、shannon指數、simpson指數以及PD whole tree,其中observed species指數和chao1指數反映樣品中群落的豐富度,即簡單指群落中物種的數量(OTU數目),而不考慮群落中每個物種的豐度情況,數值越大,說明樣品中物種越豐富;shannon指數、simpson指數以及PD whole tree反映群落的多樣性,受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響,shannon、simpson指數以及PD whole tree的值越大,說明樣品群落多樣性越高。

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